Темнопольная микроскопия
В микробиологических исследованиях довольно часто есть необходимость исследования объектов, которые являются прозрачными и полупрозрачными, не поглощающими свет. То есть, при исследовании их в светлом поле визуализировать их просто невозможно.
Именно темнопольный микроскоп может помочь исследователям в этом. Данное оборудование использует метод темного поля метод темного поля в микроскопии. Что это означает?
Темнопольный микроскоп: принцип работы
Чем темнопольный микроскоп отличается от обычного светового микроскопа?
Свет, который проходит через исследуемый объект на предметном столике, попадает в объектив не сразу. Он проходит через конденсор темного поля, а картинка формируется только светом.
Основной особенностью микроскопов такого типа является само освещение, которое падает на исследуемый образец. Оно является по своей сути боковым. При попадании данного света на границы объекта, данный свет рассеивается, в итоге мы видим объект в рассеянном свете. А сам световой пучок, который исходит из осветителя микроскопа, попросту становится невидимым глазу человека.
Сравнивая изображения в светлопольном и темнопольном микроскопах может сложиться ошибочное мнение о том, что картинка в темнопольном микроскопе может быть названа негативом исследуемого объекта по отношению к таковой в светлопольном оборудовании. Однако, это не так. Просто при микроскопировании с помощью этих двух методов визуализируются различные части одного и того же объекта.
Темнопольный микроскоп: диагностика в лабораторных условиях
Темнопольные микроскопы являются помощниками в работе врачей-микробиологов, бактериологов, темнопольная микроскопия применяется для изучения крови при гемосканировании.
Диагностика по капле крови на темнопольном микроскопе производится в условиях медицинской лаборатории, когда врачу необходимо отследить информацию о живых клеточных структурах крови. Для исследования берется капля капиллярной крови, которая сразу же вноситься на предметное стекло темнопольного микроскопа. В результате такого исследования можно визуализировать передвижение форменных элементов крови и делать выводы касательно них.
Преимущества и недостатки темнопольной микроскопии
Главное преимущества метода использования микроскопии в темном поле – это реальная возможность изучения прозрачных объектов, визуализация который просто невозможна путем применения способа светлопольной микроскопии. Это основная задача оборудования такого типа.
При наличии такой необходимости такой микроскоп доукомплектовывается видеоокуляром, а программное обеспечение с легкостью может позволить вывести изображение на экран монитора компьютера. Это дает возможность применения дополнительных фильтров, сохранения полученной информации на электронные носители.
Однако, исходя из требований к работе такого аппарата могут исходить и недостатки такой микроскопии.
6.3. Методы наблюдения
Обычно предметы, исследуемые под микроскопом, сами не светятся и, следовательно, нуждаются в постороннем освещении. Во многих случаях рассматриваемые предметы представляют собой тонкий срез прозрачного вещества и наблюдаются в проходящем свете. В системах с небольшой числовой апертурой (до 0.25) вполне достаточно рассеянного дневного света, отраженного под углом от вогнутого зеркала. В других случаях необходимо пользоваться искусственными источниками и специальными осветительными системами (см. главу 7).
Структуру препарата, рассматриваемого через микроскоп, можно различить лишь тогда, когда частицы препарата отличаются друг от друга и от окружающей их среды по поглощению (отражению) света или по показателю преломления. Поэтому, в зависимости от характера препарата, в микроскопии применяются различные методы наблюдения.
6.3.1. Метод светлого поля
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие). Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Поглощающие элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет.
Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов, биологических тканей и различных минералов. Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы. Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.
6.3.2. Метод темного поля
Метод темного поля в проходящем свете применяется в биологии, коллоидной химии, минералогии и других областях для получения изображений прозрачных, непоглощающих, а поэтому и не видимых при наблюдении в светлом поле объектов. Пучок лучей, освещающих препарат, непосредственно в объектив не попадает. Изображение создается только светом, который рассеивается мелкоструктурными элементами препарата. В поле зрения микроскопа на темном фоне видны светлые изображения мелких деталей, тогда как у крупных деталей видны только светлые края, которые рассеивают освещающие лучи.
Метод темного поля в отраженном свете осуществляется путем освещения препарата, например шлифа металла или биологической ткани, сверху с помощью специальной кольцевой зеркальной системы, расположенной вокруг объектива. Так же как и при проходящем свете, изображение создается только лучами, рассеянными объектом, тогда как лучи света, отразившиеся от поверхности объекта, в объектив не попадают.
6.3.3. Метод исследования в поляризованных лучах
Метод исследования в поляризованных лучах применяется в проходящем и в отраженном свете для так называемых анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Такими объектами являются многие минералы, угли, некоторые животные и растительные ткани и клетки, искусственные и естественные волокна.
При исследовании анизотропных препаратов к обычной схеме микроскопа перед осветительной системой добавляют поляризатор, а после объектива – анализатор, находящиеся в скрещенном либо параллельном положении относительно друг друга. При скрещенных поляризаторе и анализаторе в темном поле зрения микроскопа видны темные, светлые или окрашенные анизотропные элементы объекта. Вид этих элементов зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации и от величины двойного лучепреломления. Более точное определение оптических данных объекта делается с помощью различных компенсаторов (неподвижных кристаллических пластинок, подвижных клиньев и пластинок).
6.3.4. Метод фазового контраста
Метод фазового контраста дает возможность получать контрастные изображения прозрачных и бесцветных объектов. К числу таких объектов относятся, например, неокрашенные биологические препараты, нетравленые шлифы металлов и минералогические объекты. Темные и светлые места в фазово-контрастном изображении соответствуют различным показателям преломления в препарате.
Принцип действия метода основан на том, что незаметные для глаза изменения фазы пучка, прошедшего через объект, можно преобразовать в видимое изменение интенсивности. На пути лучей, не отклоненных из-за дифракции на объекте, располагается так называемая «фазовая пластинка», увеличивающая разность фаз до половины длины волны. Таким образом, лучи могут интерферировать, и прежде не видимый объект проявляется на темном или светлом фоне.
Микроскопия: метод темного поля
Микроскопия: метод темного поля
Метод темного поля в основном используется для изучения в проходящем свете прозрачных неабсорбирующих объектов, которые невозможно наблюдать методом светлого поля. Чаще всего – биологических, например бактерий и простейших. В отраженном свете можно также изучать и непрозрачные образцы, например шлифы металлов.
Принцип работы следующий. Свет от осветителя проходит через специальный конденсор темного поля, который формирует пучок лучей в виде полого конуса и направляет его на исследуемый препарат. Основная часть лучей проходит мимо объектива, а изображение формируется только светом, рассеянным неоднородной структурой образца. В поле зрения микроскопа на темном фоне отображаются светлые участки структуры препарата и крупные частицы со светлыми краями, имеющие отличный от окружающей среды показатель преломления.
Для проведения исследований в темном поле необходимо использовать микроскопы особой конструкции или специальные темнопольные конденсоры, которые устанавливаются на место штатного конденсора.
Недостатки и преимущества исследований по методу темного поля
Как и любой метод исследований, темнопольная микроскопия имеет свои преимущества и недостатки.
Основной плюс этого метода – возможность работать с прозрачными объектами, которые нельзя наблюдать в светлом поле. А недостатки определяются физическими ограничениями.
Во-первых, это необходимость использовать очень мощные источники света, которые зачастую могут повредить образец. Это связано с тем, что для формирования изображения используется малая часть исходного света, а большая его часть не попадает в объектив. Но, например, при работе с мощным лазерным освещением препарат можно просто-напросто случайно сжечь.
Во-вторых, апертура конденсора должна быть существенно выше апертуры объектива микроскопа, что сильно сказывается на разрешающей способности последнего. Максимальное значение апертуры объектива для работы по методу темного поля может составлять 1,2, а зачастую и того меньше – 0,8. Для сравнения, этот же показатель у светопольного объектива может достигать 1,45.
В-третьих, для работы по методу темного поля нельзя использовать толстые предметные стекла. При большой толщине предметного стекла невозможно получить правильное освещение образца, так как фокус конденсора смещается с препарата внутрь стекла. Например, с конденсором темного поля ОИ-13 можно использовать только стекла толщиной не более 1,2 мм.
В-четвертых, по получаемому изображению нельзя ничего сказать о прозрачности частиц образца и о том, какой показатель преломления они имеют.
На первый взгляд может показаться, что метод темного поля проигрывает исследованиям в светлом поле, однако это не совсем так. Не стоит забывать, что прозрачные образцы невозможно исследовать в светлом поле. Кроме того, каждый из этих методов выделяет разные особенности образца. Светлопольная микроскопия делает видимыми резкие переходы и крупные элементы, которые отбрасывают тени, а плавные изменения лучше отражает метод темнопольной микроскопии.
Конденсор темного поля: особенности и порядок работы
Конденсор темного поля – это элемент осветительной системы микроскопа, представляющий собой систему линз. Он устанавливается в том случае, когда планируются исследования по методу темного поля. Задача конденсора – собрать максимальное количество света от источника освещения и направить его на исследуемый образец. Конденсор способен значительно усиливать освещенность препарата, за счет фокусировки на нем в том числе и тех лучей, которые при отсутствии конденсора прошли бы мимо препарата.
Типовая схема устройства представлена на изображениях выше (конденсор темного поля ОИ-13). Сферическое зеркало (1) склеено с линзой-кардиоидой (2) и вставлено в оправу (3). Вся конструкция помещена в цилиндр (4) и закреплена в корпусе конденсора (5). При помощи винтов настройки (6) можно корректировать местоположение конденсора относительно поля зрения микроскопа. Конденсор считается идеально отцентрированным в том случае, если при отсутствии образца в выходном зрачке объектива не видно света.
Размещается конденсор между источником освещения и предметным столиком таким образом, что последний соприкасается с верхней линзой конденсора.
Для проведения наблюдений по методу темного поля необходимо:
Особенности эксплуатации
Обратите внимание, что темнопольный конденсор не рассчитан на эксплуатацию при отрицательных температурах, оптимальный температурный диапазон составляет от +10 до +35 °C, поскольку преломляющие свойства иммерсионной жидкости меняются за пределами указанного температурного диапазона.
В интернет-магазине «Четыре глаза» вы можете выбрать и купить темнопольный микроскоп, а также конденсор темного поля.
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Исследование в темном поле
Зарабатывайте вместе с нами!
Вы будете получать привлекательную комиссию с каждого заказа!
Микроскопия: метод темного поля
Метод темного поля в основном используется для изучения в проходящем свете прозрачных неабсорбирующих объектов, которые невозможно наблюдать методом светлого поля. Чаще всего – биологических, например бактерий и простейших. В отраженном свете можно также изучать и непрозрачные образцы, например шлифы металлов.
Принцип работы следующий. Свет от осветителя проходит через специальный конденсор темного поля, который формирует пучок лучей в виде полого конуса и направляет его на исследуемый препарат. Основная часть лучей проходит мимо объектива, а изображение формируется только светом, рассеянным неоднородной структурой образца. В поле зрения микроскопа на темном фоне отображаются светлые участки структуры препарата и крупные частицы со светлыми краями, имеющие отличный от окружающей среды показатель преломления.
Для проведения исследований в темном поле необходимо использовать микроскопы особой конструкции или специальные темнопольные конденсоры, которые устанавливаются на место штатного конденсора.
Недостатки и преимущества исследований по методу темного поля
Как и любой метод исследований, темнопольная микроскопия имеет свои преимущества и недостатки.
Основной плюс этого метода – возможность работать с прозрачными объектами, которые нельзя наблюдать в светлом поле. А недостатки определяются физическими ограничениями.
Во-первых, это необходимость использовать очень мощные источники света, которые зачастую могут повредить образец. Это связано с тем, что для формирования изображения используется малая часть исходного света, а большая его часть не попадает в объектив. Но, например, при работе с мощным лазерным освещением препарат можно просто-напросто случайно сжечь.
Во-вторых, апертура конденсора должна быть существенно выше апертуры объектива микроскопа, что сильно сказывается на разрешающей способности последнего. Максимальное значение апертуры объектива для работы по методу темного поля может составлять 1,2, а зачастую и того меньше – 0,8. Для сравнения, этот же показатель у светопольного объектива может достигать 1,45.
В-третьих, для работы по методу темного поля нельзя использовать толстые предметные стекла. При большой толщине предметного стекла невозможно получить правильное освещение образца, так как фокус конденсора смещается с препарата внутрь стекла. Например, с конденсором темного поля ОИ-13 можно использовать только стекла толщиной не более 1,2 мм.
В-четвертых, по получаемому изображению нельзя ничего сказать о прозрачности частиц образца и о том, какой показатель преломления они имеют.
На первый взгляд может показаться, что метод темного поля проигрывает исследованиям в светлом поле, однако это не совсем так. Не стоит забывать, что прозрачные образцы невозможно исследовать в светлом поле. Кроме того, каждый из этих методов выделяет разные особенности образца. Светлопольная микроскопия делает видимыми резкие переходы и крупные элементы, которые отбрасывают тени, а плавные изменения лучше отражает метод темнопольной микроскопии.
Конденсор темного поля: особенности и порядок работы
Конденсор темного поля – это элемент осветительной системы микроскопа, представляющий собой систему линз. Он устанавливается в том случае, когда планируются исследования по методу темного поля. Задача конденсора – собрать максимальное количество света от источника освещения и направить его на исследуемый образец. Конденсор способен значительно усиливать освещенность препарата, за счет фокусировки на нем в том числе и тех лучей, которые при отсутствии конденсора прошли бы мимо препарата.
Типовая схема устройства представлена на изображениях выше (конденсор темного поля ОИ-13). Сферическое зеркало (1) склеено с линзой-кардиоидой (2) и вставлено в оправу (3). Вся конструкция помещена в цилиндр (4) и закреплена в корпусе конденсора (5). При помощи винтов настройки (6) можно корректировать местоположение конденсора относительно поля зрения микроскопа. Конденсор считается идеально отцентрированным в том случае, если при отсутствии образца в выходном зрачке объектива не видно света.
Размещается конденсор между источником освещения и предметным столиком таким образом, что последний соприкасается с верхней линзой конденсора.
Для проведения наблюдений по методу темного поля необходимо:
Особенности эксплуатации
Обратите внимание, что темнопольный конденсор не рассчитан на эксплуатацию при отрицательных температурах, оптимальный температурный диапазон составляет от +10 до +35 °C, поскольку преломляющие свойства иммерсионной жидкости меняются за пределами указанного температурного диапазона.
В интернет-магазине «Четыре глаза» вы можете выбрать и купить темнопольный микроскоп, а также конденсор темного поля.
4glaza.ru
Ноябрь 2015
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Исследование в темном поле
В основе принципа микроскопических исследований (в прикладном понимании, конечно) лежит ответ на вопрос: как взаимодействует видимый свет с поверхностью исследуемого материала? Как использовать это взаимодействие, как его зарегистрировать и как истолковать?
Структуру образца можно различить лишь тогда, когда различные его участки по-разному отражают, преломляют или пропускают свет. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, отразившихся от различных участков поверхности, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов. Объекты исследования в металлографии зачастую являются настолько сложными в структурном отношении, что бывает трудно заранее определить, какая методика анализа (способ освещения) является оптимальной. Даже квалифицированный исследователь зачастую вынужден пробовать различные способы освещения и фильтры для получения наилучшего изображения структуры. Поэтому важно показать видоизменение изображения структуры материала при использовании светлого поля, темного поля, поляризованного света, и т.д. чтобы продемонстрировать возможности анализа.
Исходя из нашего опыта применения различных методик, наиболее информативными в исследовании материалов являются темное и светлое поле. Методы анализа на основе поляризованного света применяются несколько реже, но и им находится достойное место.
В настоящее время в сети Интернет содержится довольно много информации о темнопольной микроскопии. Основная масса информации посвящена вопросам биологического направления – например рассматривается применение темнопольного освещения для исследования препаратов крови (гемосканирование). Приводится многочисленная реклама темнопольных микроскопов. Но практически нет информации о применении темного поля для металлографических исследований; в особенности трудно найти иллюстрации возможностей метода, выполненные на современном оборудовании. Вероятно, в силу того, что метод темнопольной микроскопии в металлографии известен давно и к нему успели привыкнуть, а потом и забыть.
Методы светлого и темного поля
Метод светлого поля является основным в металлографии и применяется для наблюдения непрозрачных объектов, отражающих свет. При освещении по методу светлого поля объект освещается конусом лучей, прошедших через объектив микроскопа. При этом в формировании изображения участвует весь конус света. Превалирующими являются центральные лучи конуса, параллельные оси объектива, которые, в сущности, и определяют характер освещения объекта.
При наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете поверхность освещают через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпи-конденсором. Фактически, принцип темного поля заключается в блокировке центрального пучка лучей. Образец освещается полым конусом света, и в формировании изображения участвуют только лучи, ориентированные наклонно к поверхности образца. Темнопольное освещение позволяет расширить возможности металлографического микроскопа в исследовании неплоскостных объектов.
Рисунок 1. Схема освещения объекта при использовании светлого (а) и темного (б) поля.
На рисунке 1 приведены схемы освещения при использовании светлого и темного поля. При светлопольном варианте освещения на поверхности образца видно пятно света. При темнопольном освещении центр затемнен. Реальные изображения светового пятна на белой бумаге при обоих способах освещения приведены на рисунке 2. Для большей наглядности поверхность бумаги находится ниже фокуса.
 |  |
| а | б |
Рисунок 2. Освещение объекта при использовании светлого (а) и темного (б) поля.
На рисунке 3 приведена схема отражения света от поверхности металлографического шлифа при светлопольном освещении. В случае ровной полированной поверхности свет отражается и попадает в объектив (1). После травления на микроструктуру за счет формирования канавок в месте стыка соседних зерен (или фаз) отражение происходит от криволинейной поверхности и отраженный свет не попадает в объектив (2) и граница зерна видна как темная линия. Если травление отсутствует или граница не вытравилась по каким-либо причинам (3), то свет отражается поверхностью аналогично варианту 1 и граница зерна не видна.
При темнопольном методе освещения формирование изображения поверхности образца будет происходить согласно схеме на рисунке 4. Ровный участок поверхности (1) окажется неосвещенным, так как отраженный свет не попадет в объектив микроскопа; тело зерна будет темным. Наклонный участок, в частности вытравившаяся граница зерна, окажется в отражающем положении и будет видна как светлая полоса на темном фоне (2). На участке (3) изображение поверхности также будет темным.
Сравнение светлопольного и темнопольного изображения зеренной структуры после металлографического травления приведено на рисунке 5. На светлопольном изображении (рис.5,а) хорошо протравленные границы зерен выглядят темными на светлом фоне (вариант 2 по рис.3). Тело зерна освещено максимально (вариант 1 по рис.3). Слабо протравившиеся границы (вариант 3 по рис.3) отмечены стрелками. Изображение, сформированное при освещении по методу темного поля (рис.5,б), в данном случае воспринимается как негативное по отношению к изображению на рис. 5,а. Тело зерна не освещено, границы «светятся» в соответствии с тем, насколько сильно они вытравились.
 |  |
| а | б |
Царапины и различные включения в светлом поле выглядят темными на фоне освещенного тела зерна (рис.5,а). В темном поле (рис.5,б) царапины и включения освещены.
При наблюдении неровной поверхности в светлом поле ее можно практически не увидеть в связи с сильным рассеянием света. Освещение в темном поле зрения создает контрастные изображения и сохраняет натуральный вид окрашенных объектов.
 |  |
| а | б |
Рисунок 6. Металлическая поверхность сложной конфигурации: а – светлопольное изображение; б – темнопольное.
15 % площади шлифа. Перлит имеет пластинчатое строение, его среднее количество составляет
 |  |
| а | б |
Рисунок 7. Микроструктура основного металла трубы 1 (а) и трубы 2 (б)
Видимые отличия в структуре металла труб проявляются при исследовании их по методу темного поля. На рис. 8 видна четкая светимость нижних краев перлитных полос у трубы 2 (рис.8б), в то время как у трубы 1 такого эффекта не наблюдается (рис.8а). Можно заметить направленность структуры образца трубы 2.
 |  |
| а | б |
Рис. 8. Микроструктура основного металла трубы 1 (а) и трубы 2 (б) при увеличении 400 х ; темнопольное освещение
При детальном исследовании с увеличением 2000 х обнаружено, что светящаяся окантовка перлитных и частично ферритных зерен в хрупком металле трубы 2 представлена непрерывными цепочками шириной не более 5 мкм, окаймляющими перлитные и ферритные зерна и идентифицированными как структурно свободный цементит (рис. 9). Цепочки цементита по границам перлитных и ферритных зерен в трубе 2 обозначены стрелками. Известно, что зернограничное выделение твердой и хрупкой фазы, каковой является цементит, ослабляющей прочность межзеренного сцепления, приводит к резкому падению ударной вязкости и росту критической температуры хрупкости и, следовательно, ведет к охрупчиванию стали.
 |  |
| а | б |
Рис. 9. Микроструктура основного металла трубы 2 в светлом (а) и темном (б) полях
При исследовании металла трубы 1 непрерывные цепочки цементита не обнаружены. В темном поле светятся отдельные его глобулярные включения, равномерно расположенные в небольших количествах как по границам ферритных и перлитных, так и в теле ферритных зерен (рис. 10).
 |  |
| а | б |
Рис. 10. Микроструктура основного металла трубы 1 в светлом (а) и темном (б) полях
Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что основной причиной хрупкости основного металла газопроводной трубы, изготовленной и стали 17ГС, является структурный фактор в виде зернограничных цементитных прослоек. Данный вывод однозначно подтверждается металлографическими исследованиями в темном поле.
