Анатомия хмеля
Хмель — удивительное растение. Его небольшие шишковидные соплодия придают пиву характерную горечь, а также широкую гамму ароматов и вкусовых свойств. Для производства пива используются женские цветки хмеля обыкновенного (Humulus lupulus). Изначально хмель применялся, скорее, из-за его антибактериальных, чем вкусовых свойств. Сегодня его маленькие шишки популярны в первую очередь благодаря их ароматическим и вкусовым характеристикам, но они также способствуют разрушению нежелательных микроорганизмов в пиве. О строении хмеля рассказывает Брайан Патрик на сайте Craft Beer Academy. Pivo.by публикует перевод материала.
Фото: Leah Pellegrini
Выращивание хмеля
Прежде чем приступать к описанию анатомического строения хмеля, остановимся на том, где произрастает это растение и для чего оно используется. Первое использование хмеля в пивоварении относится к XI веку, а в более ранний период для придания пиву горечи добавляли другие растения и травы, среди которых были одуванчик, корень лопуха, бархатцы, шандра, будра плющевидная и вереск.
Хмель выращивается в условиях влажного умеренного климата. Следовательно, подавляющая часть мировых посевных площадей хмеля сосредоточена в северном полушарии вокруг 48 параллели. Хмель любит почву, подходящую для посевов картофеля, поэтому ведущие штаты по выращиванию картофеля в США также являются крупнейшими производителями хмеля. Это конечно не означает, что хмель может расти одинаково хорошо на всех почвах, где выращивается картофель, однако наличие последнего является довольно неплохим тому показателем.
Период сбора урожая хмеля приходится на конец лета. Стебли растения срезают, а собранные с них шишки отправляют в специальную сушильню. Чаще всего, она представляет собой двухэтажное строение, на верхнем этаже которого уложен решетчатый пол, покрытый мешковиной. На него равномерно выкладывают собранные шишки хмеля, для сушки которых используется нагревательная установка, размещённая на нижнем этаже здания. Но также для сушки хмеля используются специальные машины. Высушенный хмель плотно прессуют. Для этого два длинных отреза мешковины помещают в пресс-машину под прямым углом, на них высыпают сухие шишки растения, которые затем прессуют и упаковывают в тканевые мешки. Именно такой свежевысушенный хмель может использоваться для так называемого «пива со свежим хмелем».
После сушки и упаковки хмель может пройти дополнительные этапы обработки, включая гранулирование, которые позволяют его использовать в любое время года, а также способствуют сохранению эфирного масла растения, которое придаёт пиву характерный вкус и аромат. Шишечные соплодия хмеля могут не подвергать дальнейшей обработке, но их использование в пивоварении в необработанном виде является дорогостоящим, поэтому, как правило, оно происходит сразу после сбора урожая растения, когда его шишки ещё не утратили свою свежесть.
Помимо фактов о том, где он произрастает и для каких целей используется, есть немало другой, не менее интересной информации о хмеле. Цветок хмеля представляет собой невероятно сложную и деликатную структуру, необычность которой нельзя не оценить по достоинству. Пришло время отдать дань уважения этому ценнейшему пивному ингредиенту и пройти урок анатомии о строении хмеля.
Анатомия хмеля
В хмеле выделяют четыре ключевых компонента, которые и отвечают за «магию» этого растения. У основания шишки расположена плодоножка. Плодоножка — это стеблевой орган, несущий плод, и место соединения соплодия растения с его стеблем. Большая часть танинов, содержащихся в шишке хмеля, сосредоточены в его плодоножке. Будучи полифенолами, танины отвечают за лекарственные свойства хмеля, для которого характерен один из самых высоких уровней содержания полифенолов среди растений (4–6 масс. %). В зависимости от сорта хмеля, они подчеркивают или сглаживают его горечь. Следовательно, размеры плодоножки являются важным фактором в процессе пивоварения.
За плодоножкой идет прицветник. Прицветник хмеля — это его видоизменённый лист, в пазухе которого располагается цветок и соцветие. После варки пива эта часть растения утилизируется. А ведь в прицветнике хмеля также содержатся полифенолы, которые, согласно результатам исследований, способствуют эффективному лечению стоматологических заболеваний, что повышает ценность его отходов.
Ещё одним компонентом соцветия является прицветничек. Он расположен между прицветником и цветком хмеля и служит в качестве опорной структуры. Именно за ним скрывается последняя деталь «мозаики» этого растения и его самый ценный элемент. И если желёзки с лупулином (о которых поговорим позднее) являются основным источником хмелевого вкуса, горечи и аромата, в предцветничках, как и в предцветниках, содержатся ключевые компоненты хмеля, которые играют не менее важную роль в пивоварении. Шишковидные соплодия растения буквально источают лупулин, свойства которого незаменимы для производства пива.
Фото: The New School
Компонент хмеля, представляющий наибольший интерес для пивоваров и любителей пива, — это хрупкие и чувствительные желёзки с лупулином. Защищённые прицветником, они являются богатым источником смол и эфирного масла. Чтобы увидеть желёзки, достаточно разделить шишковидное соплодие хмеля на две части. Они имеют желтоватую окраску, напоминающую цвет пыльцы, и ярко выраженный запах хмеля.
Желёзки содержат целый ряд химических веществ, тремя наиболее важными из которых являются альфа-кислоты, бета-кислоты и эфирное масло. Эти вещества играют важную роль в пивоварении, и именно на них ориентируются пивовары при выборе хмеля для производства определённого стиля пива.
Цветки хмеля очень хрупкие, но без них полюбившиеся нам горечь и вкус крафтового пива будут уже не те. Существует сотни разновидностей хмеля, ареал распространения которых протянулся от северо-запада США до Великобритании и Новой Зеландии. Они существенно отличаются друг от друга по ароматическим и вкусовым характеристикам, степени горечи и содержанию эфирного масла, поэтому появление новых сортов хмеля всегда широко приветствуется специалистами пивоваренной отрасли.
Зная анатомическое строение хмеля и его особенности, вы сможете извлечь максимальную пользу из этого растения в процессе домашнего пивоварения и по-настоящему насладиться крафтовым пивом.
Необыкновенный хмель обыкновенный
Исторические документы свидетельствуют о том, что в России с хмелем были знакомы уже в Х веке. Дикий хмель использовали для приготовления пива, браги и слабых алкогольных напитков.
Сегодня шишки хмеля — незаменимое сырье для пивоваренной промышленности. Содержащиеся в них специфические смолистые и дубильные вещества, эфирные масла придают пиву характерный хмелевой аромат, горький вкус способствуют пеностойкости.
Хмель обыкновенный используют в качестве лекарственного растения. Для этого собирают женские соцветия (шишки), когда они приобретают зеленовато-желтую окраску. Эфирное масло и особые смолы, которые содержатся в соцветиях, обладают мягким успокаивающим действием. Экстракты хмеля входят в состав многих седативных лекарственных препаратов, наиболее известные среди них — валокордин, седавит, уролесан. Травяная подушка, наполненная шишками, — отличное средство от бессонницы, а отвар шишек издавна использовали как средство для укрепления волос. Хмель обладает успокаивающим, снотворным, противосудорожным, болеутоляющим и антибактериальным действиями. Он помогает при отеках, язвенной болезни, воспалении слизистой оболочки желудка.
Что любит хмель
Хмель — многолетняя трудоемкая техническая культура. Растет на одном месте 20 и более лет. Требует умеренно теплого и влажного климата. Оптимальная среднесуточная температура воздуха во время вегетации +15—17°С, без резких колебаний днем и ночью. Слабые весенние заморозки приводят к пожелтению растений. При более сильных заморозках (–5°С) побеги теряют тургор и выглядят увядшими, но со временем восстанавливаются, хотя на стеблях остаются изгибы, сильно уменьшается урожай шишек. Высокие урожаи хмеля получают в местностях, где сумма годовых осадков составляет 500—600 мм с равномерным распределением их по периодам роста и развития растения.
Хмель требует хорошо окультуренных, правильно обработанных плодородных почв (желателен богатый плодородный суглинок, влажный, но не переувлажненный, с песчаной, пропускающей воду подпочвой). Лучше развивается в полутенистых местах, но может расти и на солнце. Для его выращивания используют шпалеры для поддержки надземной части растений и сушилки для обработки готового сырья. Стебли хмеля, своевременно заведенные на поддержки, растут очень быстро. При благоприятных условиях суточный прирост их в июне достигает 20—25 см, а в некоторых случаях и больше.
Всходы — побеги от подземной части стеблей — появляются ранней весной, как только оттает и прогреется почва. В этой фазе проводят обрезку хмеля.
Рост стеблей и развитие листьев начинаются с развития на стебле первой пары листьев. В этой фазе проводят рамование, заводку стеблей на поддержки, подкормку и рыхление междурядий.
Появление и рост боковых ветвей продолжаются до начала цветения. В этот период интенсивно растут стебли, боковые ветви, образуются цветоносные побеги и соцветия. Проводят подкормку, окучивание, рыхление междурядий, пасынкование, удаление нижних листьев и пинцировку боковых ветвей. Продолжительность цветения зависит от биологических особенностей сорта, метеорологических условий, освещения.
Формирование шишек начинается с разрастания прицветковых и покровных чешуек и продолжается до начала технической спелости. Шишки интенсивно растут, образуя лупулиновые железки, в которых накапливаются горькие вещества. Техническая спелость шишек наступает тогда, когда шишки становятся упругими, приобретают золотисто-зеленый цвет и хмелевой аромат. Содержание горьких веществ повышается и достигает максимальной величины. Шишки при сдавливании шелестят, лупулиновые железки приобретают ярко-желтый цвет.
Ежегодно зимой надземная масса ветвей и листьев полностью отмирает, сохраняются только подземные утолщенные корневища. Зимний покой подземной части наступает в зависимости от погодных условий: в октябре или в начале ноября. В этот период на хмельниках проводят обрезку стеблей и окучивание на зиму.
Посадка и уход
С осени готовят ямы или канавы глубиной 50—60 см, которые до половины заполняют навозом, а сверху засыпают землей. Посадку проводят весной саженцами или черенками. Расстояние между растениями — 1 м. После посадки растения пропалывают, рыхлят, подкармливают, поливают.
На второй год стеблей образуется меньше, но они растут быстрее и зацветают раньше. Хмель потребляет много питательных веществ и воды, поэтому для обеспечения хорошего и быстрого роста растения надо дополнительно подкармливать и поливать хотя бы первые 2—3 года.
Декоративность
Хмель — интересная культура, используемая для вертикального озеленения, а также маскировки хозяйственных построек и заборов.
Рост в первой половине лета настолько стремителен, что хмель одним из первых оплетает опоры, намного опережая такие декоративные лианы, как девичий виноград, лимонник, жимолость каприфоль. Ежедневный прирост составляет до 20 см. Стебли хмеля представляют собой тонкие, длинные вьющиеся лианы шестигранной формы. Вдоль граней имеются шипы, которыми хмель цепляется за неровную поверхность опоры, поднимается вверх, завиваясь слева направо по ходу часовой стрелки тремя верхними междоузлиями. Стебли хмеля чувствительны к направлению роста. В вертикальном положении они быстро взбираются по опорам, в горизонтальном темпы роста существенно снижаются. Чтобы вырастить сплошную зеленую стену, растения сажают с интервалом 1,5—2 м. Зная эту особенность, можно быстро задекорировать даже самые невзрачные садовые постройки.
Увитый хмелем забор уже во второй половине июня превращается в густую живую изгородь, а каркас из металлических труб становится ажурной беседкой, лишь только побеги сомкнутся на его вершине. Взрослый, хорошо развитый экземпляр хмеля уже к середине лета образует густое переплетение стеблей и листьев.
У хмеля имеется недостаток, обнаруживающий себя в конце лета: нижние листья на лианах желтеют и опадают, оголяя побеги. Вторая и очень серьезная проблема хмельника в жаркое и сухое лето — атаки тли и клещей. Если дать волю вредителям, они ослабят растение, из-за чего оно приобретет неопрятный вид. И еще: корни хмеля легко распространяются за пределы отведенного для них места, поэтому приходится принимать меры, не давая им такой возможности.
Особенности цветения
Хмель — двудомное растение. До цветения мужские и женские растения не имеют различий.
Женские соцветия хмеля колосообразные, из 20—40 очень мелких цветков, густо собранных на короткой тонкой коленчатой оси соцветия. После цветения все составные части женского соцветия сильно разрастаются, изменяются и после многократного увеличения превращаются в шишку хмеля. Шишки хмеля собраны в метелковидные грозди по 40—50 шт.
Мужские соцветия хмеля представляют собой сильно разветвленную метелку, на которой поодиночке на коротких цветоножках расположены мелкие цветки. Мужские цветки начинают цвести на 3—4 дня раньше женских. Высыпающиеся во время цветения пыльцевые зерна могут переноситься ветром на большие расстояния (от 3 до 20 км). Кроме того, мелкие мужские цветки после цветения засыхают и осыпаются, а потому хозяйственной ценности не представляют.
Ценность хмеля обусловлена наличием в нем специфических горьких, дубильных веществ и эфирного масла. Химический состав шишек разных сортов хмеля варьирует и зависит от зоны возделывания: горькие вещества — от 8 до 24%, альфа-кислоты — от 1,5 до 12%, бета-кислоты — от 3 до 7%. Шишки хмеля содержат горькое вещество лупулин, алкалоид хумулин, эфирное масло (2%), гормоны, хлорогеновую кислоту, флавоноиды (кемпферол, кверцетин-3-глюкозид, лейкоцианидин, лейкодельфинин), кумарины, витамины (B1, В2, В6, РР), дубильные вещества (до 3,4%), макро- и микроэлементы, золу. В побегах и листьях имеется большое количество аскорбиновой кислоты.
Размножение
Хмель размножают делением корневищ, корневыми отпрысками, зелеными черенками, реже семенами. Корневища отделяют от основных корней острой лопатой, не выкапывая куста, прямо в земле.
В отделе биотехнологии Института плодоводства для ускоренного размножения в сочетании с оздоровлением растений разработали методику микроразмножения и адаптации сортов хмеля для закладки промышленных плантаций в условиях Беларуси. Это позволяет получить до тысячи микрорастений с одной меристемы. Саженцы, полученные из этих черенков, свободны от фитопатогенной и вирусной инфекции.
Манана КАСТРИЦКАЯ,
ведущий научный сотрудник Института плодоводства,
кандидат сельскохозяйственных наук
Как выводят новые сорта хмеля
Сегодня селекционерам известны более 100 разновидностей хмеля. Однако, хмелеводы и производители пива постоянно находятся «в поиске» новых уникальных сортов, обладающих особенными свойствами. Главный редактор издания Brew Your Own Крис Колби детально описывает процесс выведения новых видов этого незаменимого в пивоварении растения, начиная от первого сеянца и заканчивая поставкой «готового» продукта производителю.
Разновидности и классификация хмеля
Как известно, качество и аромат пива зависят от сорта хмеля. Однако, далеко не каждый любитель этого «народного напитка» знает о том, что сорта хмеля — это отнюдь не «подарок» природы, а результат длительного и кропотливого труда профессиональных селекционеров.
Базовыми ингредиентами, необходимыми для производства пива, являются вода (H₂O), солод, хмель и дрожжи (грибы Saccharomyces Cerevisiae). Солод получают из ячменя (Hordeum vulgare) — цветкового растения с характерным душистым ароматом. Как и все злаковые культуры, ячмень — однодольное растение, семена которого содержат один «зачаточный лист».
Хмель (Humulus lupulus) также является цветковым растением, однако, в отличии от солода, он имеет два зачаточных листа, и относится к классу двудольных покрытосеменных растений. Кроме того, хмель является близким «родственником» розоцветных (к которым относятся розы, клубника, яблоки, персики) и коноплёвых (в том числе, конопля).
На сегодняшний день селекционерам известны 3 разновидности хмеля:
Из всех перечисленных видов данного растения в промышленном пивоварении используется только Humulus lupulus.
Половая классификация хмеля
Хмель является растением двудомным. Это значит, что у него присутствуют как женские, так и мужские цветы, произрастающие на отдельных растениях. Визуально цветы хмеля ничем не примечательны. Данное растение не может похвастаться большими лепестками или красивым ярким соцветием.
Как правило, дикорастущие разновидности хмеля — диплоидные (обладающие двумя наборами «материнских» и «отцовских» хромосом). Большинство искусственно выведенных (коммерческих) сортов хмеля являются триплоидными (имеющими три и более наборов хромосом). Последняя хромосома отвечает за половую принадлежность растения.
Набор хромосом XX «формируют» женский пол хмеля, XY — мужской. При этом стоит отметить, что хромосомы растения не гомологичны, т.е. с научной точки зрения, не могут отождествляться с человеческими.
Особенность размножение хмеля
В естественных условиях хмель размножается половым путем. Попадая на «шишку» женского растения, пыльца мужского цветка оплодотворяет яйцеклетку. Последняя (по аналогии с мужским геномом) имеет по одной копии каждой из 10 хромосом. В результате такого «слияния» формируется зигота, содержащая уже две копии каждой из 10 «родительских» хромосом. После процесса оплодотворения диплоидная зигота «трансформируется» в семя, из которого, в последствии, произрастает сеянец (женское, либо мужское растение).
Хмель производит не только стебли, но и корневища — так называемые, «ризомы» (отростки, способные формировать как наземные, так и подземные ростки).
Клонирование хмеля
В коммерческих (промышленных) целях хмель размножают бесполым путём. В процессе клонирования селекционеры используют исключительно женские растения. И это вполне оправдано, так как именно они дают стробилы (семенные шишки с лупулиновыми железами), содержащими уникальные эфирные масла, а также альфа- и бета-кислоты, необходимые для производства качественного пива. Образование семян в данном случае, крайне нежелательно, так как они значительно снижают «ценность» готового продукта.
Рост и развитие хмеля
Побег хмеля является разновидностью виноградной лозы. В естественных (природных) условиях побеги растения произрастают на деревьях, кустарниках, заборах и других «доступных» ему опорах. В некоторых случаях, хмель может достигать 8-9 метров как в длину, так и высоту. В конце лета хмель зацветает, а на его стеблях «завязываются» шишки, причем, наибольшая их концентрация наблюдается в верхней части растения.
Выращивание хмеля на фермах
На фермерских плантациях хмель высаживается в виде ризом (клубней). Новые ризомы получают методом «отсечения» небольшой части корня от имеющегося взрослого растения. Для успешной высадки саженца достаточным является размер корневища, не превышающий длины человеческого пальца.
Спустя три года после высадки корневище хмеля вырастает до размера тыквы. Особенно крупные корневища именуются «коронами», разделив которые, можно получить несколько дочерних растений. Если «хмельная» плантация засажена одним сортом хмеля, по своей сути, вся она представляет собой одно растение, появившееся из одного семени, а затем разделившееся на огромное количество «клонированных» ростков.
Селекция хмеля
Выведение новых сортов хмеля — процесс сложный и трудоемкий. Для приготовления уникального продукта пивовары неустанно «ищут» его новые сорта. Фермерам же нужен сорт, отличающийся устойчивостью к болезням, хорошими показателями роста и высокой урожайностью. Не менее важный критерий качества хмеля — пригодность к длительному хранению. Селекционеры могут «создать» самый лучший сорт хмеля на планете, но если его шишки потеряют эфирные масла и альфа-кислоты через месяц, ни одна пивоваренная компания не рискнет закупить его для своего производства.
Семена, полученные в результате опыления женских цветков мужскими, высаживаются и проращиваются в теплице. Хмель гетерозиготен. Растения, полученные путем скрещивания женских растений сорта Cascade с мужскими (того же сорта), будут содержать абсолютно новую «смесь» аллелей (набора «родительских» генов). Несмотря на то, что все сеянцы представляют собой растения хмеля, каждый из них будет обладать совершенно иными (уникальными) характеристиками.
Оценка рассады
Растения с явными «недостатками» отбраковывают. Остальные саженцы выращивают в теплице в течении года, а затем «переносят» на открытый грунт. После того, как растения выросли и окрепли селекционеры оценивают их на предмет урожайности и устойчивости к различным болезням. На первом этапе тестирования проводится анализ химического состава растений, включая определение процентного содержания масел и альфа-кислот, необходимых для производства качественного пива.
Многоуровневое тестирование
Корневища хмеля, обладающие высокими качественными характеристиками, разделяют на 15-30 клонов и оценивают по тем же параметрам. Этот этап селекции необходим для того, чтобы удостовериться в «производительности» сеянцев и исключить фактор «случайности». К примеру, сеянец хмеля может обладать нужными характеристиками исключительно по причине его высадки на хорошо подготовленный и удобренный грунт. Только после многоуровневой проверки, растения, признанные пригодными, высаживают на более крупных фермах.
Промышленное тестирование хмеля
Пригодность хмеля на предмет выращивания в промышленных масштабах определяется после сбора урожая, сортировки, сушки и упаковки. В случае успешного прохождения перечисленных этапов, селекционеры решают, стоит ли продолжать выращивать тот или иной сорт растения. Главным критерием отбора в данном случае является качественно новые свойства, позволяющие «выдержать» конкуренцию на рынке.
Отбор перспективных саженцев
Селекция хмеля предполагает не только скрещивание двух высокогетерозиготных (родительских) растений, но и отбор среди их «потомков» наиболее перспективных представителей. Качественные саженцы многократно клонируются, а затем проходят ряд лабораторных и «полевых» испытаний.
С момента высадки первого саженца и до признания пригодности сорта хмеля (для выращивания в коммерческих масштабах) может пройти более 10 лет. При этом, число клонов определенного сеянца исчисляться тысячами. На каждом акре, засеянном хмелем (посаженном в соответствии со стандартным интервалом), насчитывается до 900 лунок.
На каждый сорт хмеля, одобренного специалистами и пригодного для реализации, приходится несколько сотен экспериментальных «гибридов», не прошедших селекционный отбор. Поэтому каждый раз, поднимая бокал IPA, не стоит забывать о том, что для создания качественного пенного напитка в лабораториях, теплицах и полях была проделана невероятно энергозатратная и трудоемкая работа.
Способ молекулярного маркирования пола хмеля обыкновенного (humulus lupulus l)
Владельцы патента RU 2272840:
Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности при селекции хмеля для определения пола растений на стадии проростков. Определяют пол гибридных растений хмеля на стадии сеянцев с помощью молекулярного маркирования, где используют две комбинации олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции, которые обеспечивают амплификацию специфичных для мужских растений фрагментов ДНК. Изобретение повышает эффективность селекции и позволяет сократить затраты труда, средств, площадей и времени. 3 ил., 1 табл.
Известные способы определения пола растений хмеля:
1. По морфологии мужских и женских цветков.
Предлагаемая авторами пара олигонуклеотидных праймеров
обеспечивает амплификацию в процессе ПЦР специфичного для мужских растений фрагмента ДНК, который выявляется с помощью электрофореза в агарозном геле. В указанной статье авторы приводят следующие методики:
1. 9 г свежих листьев хмеля замораживали в жидком азоте и измельчали до порошкообразного состояния.
2. Добавляли к измельченным листьям 19 мл экстрагирующего буфера (Буфер содержит 100 мМ ацетата натрия, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 2% поливинил пиролидона, 1,4% SDS, 60 мМ цистеина, рН 5,5).
3. Смесь инкубировали 30 мин при 65°С.
4. Дважды проводили очистку смесью хлороформ / изоамиловый спирт (24:1).
5. Преципитация ДНК этанолом.
6. Осажденную ДНК растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Tris и 1 мМ ЭДТА рН 8.
Условия проведения ПЦР с STS праймерами:
Начальная денатурация: 3 мин, 94°С.
Конечный синтез: 7 мин, 72°С.
Предлагаемые нами молекулярные маркеры (две комбинации олигонуклеотидных праймеров) пригодны для определения пола у широкого спектра сортообразцов хмеля. Они были опробованы на 33 мужских линиях и 53 сортобразцах (женских растениях) хмеля. Были испытаны образцы местных популяций, сорта хмеля различного эколого-географического происхождения, в том числе российские, некоторые европейские и американские сорта (см. прилагаемую таблицу). Во всех случаях пол растений был определен правильно.
Для решения указанной задачи предлагаются две комбинации олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию специфичных для мужских растений фрагментов ДНК:
11 OF 5′ GGG ACT CGG TAA CAC AGA AAG GCA
110R 5′ AGC CCC ACC TAC ACC ACG АСА АСС
(амплификация фрагмента ДНК длиной 542 пар нуклеотидов)
422F 5′ CAG TGT TTC TCT CGG GTT CTC TTG
422R 5′ ААС CAC АСА TAA TTC CCA TCT TGC
(амплификация фрагмента ДНК длиной 387 пар нуклеотидов)
Для предлагаемых комбинаций праймеров: 110F, R и 422F,R были подобраны условия проведения ПЦР, обеспечивающие хорошо воспроизводимую амплификацию специфичного фрагмента у мужских растений хмеля, проявляющегося при форезе в виде яркой полосы. На фиг.3 стрелками указаны специфичные для мужских растений (обозначены цифрами 1, 2, 3) фрагменты ДНК размером около 542пн и 387пн, полученные с комбинациями праймеров 110F,R и 422F,R соответственно. У женских растений (обозначены цифрами 4, 5, 6) указанные фрагменты ДНК не амплифицируются.
Для определения пола растений необходимо:
3) провести форез в агарозном геле.
Выделение ДНК (метод SDS).
1. Смешать измельченный образец (10-20 мг высушенных лиофилизацией листьев хмеля) с 600 мкл SDS-буфера (100 мМ Трис-PH, рН 8, 50 мМ Na2EDTA, 500 мМ NaCI, 1,25% SDS, 2% поливинил пиролидона, непосредственно перед использованием добавить в буфер 40-50 мг Na2S2O5 на каждые 10 мл). Пробирки инкубировать 45 мин в водяной бане при 60°С, переворачивая каждые 15 мин.
2. Добавить 1 объем смеси хлороформ / изоамиловый спирт (24:1), перемешивать 10-15 мин, затем центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин.
3. К надосадочной жидкости, перенесенной в новую пробирку, добавить 0,7 объема изопропанола, центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин.
Условия проведения ПЦР
Полимеразная цепная реакция проводилась в амплификаторе Терцик МС2 (АО ДНК-технология, Москва). Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл включает: Taq-буфер (Силекс М) (70 мМ Трис-HCl, рН 8,6 (25°С), 0,001% Тритон X 100, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2),
0,25 мМ каждого dNTP (Силекс М),
0,5 мкМ каждого праймера (ЗАО Синтол),
100-150 нг ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы (Силекс М),
В пробирки поверх раствора добавить 25 мкл минерального масла.
| Циклы ПЦР: | |
| начальная денатурация: 94°С | 5 мин |
| 30 циклов: | |
| 94°С | 1 мин |
| 110F, R-58° 422F,R-60°C | 1,5 мин |
| 72°С | 45 сек |
| конечный синтез: 72°С | 7 мин |
Для фореза можно использовать 1.5% агарозный гель и 0,5х Трис-борат буфер (0,089М Трис, 0,089М борная кислота, 0,002М ЭДТА).
Таким образом, способ молекулярного маркирования позволяет определять пол гибридных растений хмеля на стадии сеянцев, что повышает эффективность селекции за счет сокращения затрат труда, средств, площадей (в теплицах или в поле) и времени (1-2 года), требуемых на возделывание мужских гибридных растений хмеля до начала цветения, когда появляется возможность их отбраковки.
Способ молекулярного маркирования пола хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L), включающий проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающийся тем, что используют комбинацию олигонуклеотидных праймеров 5′ GGG ACT CGG TAA CAC AGA AAG GCA и 5′-AGC CCC ACC TAC ACC ACG ACA ACC, которая обеспечивает синтез специфичного для мужских растений хмеля фрагмента ДНК размером 542 пн, и комбинацию олигонуклеотидных праймеров 5’CAG TGT TTC TCT CGG GTT CTC TTG и 5′ AAC CAC ACA TAA TTC CCA TCT TGC, которая обеспечивает синтез специфичного для мужских растений хмеля фрагмента ДНК размером 387 пн.
